AK-FS-01: Xác định Aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) với HPLC-FLD

Giải pháp ứng dụng “chìa khóa trao tay” :

Xác định Aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) trong Bắp và đậu phộng của HPLC-FLD Sử dụng Tiền cột( Pre-column) ái lực miễn dịch và Post-Column Dẫn xuất điện hóa

Appicaiton No./ (Giải pháp ứng dụng số): AK-FS-01

Bao gồm: Thiết bị phân tích/ thiết bị chuẩn bị mẫu/ hóa chất/ chất chuẩn/ đào tạo chuyển giao phương pháp

Giới thiệu:

• Aflatoxin được tạo ra dưới dạng chất chuyển hóa bởi Aspergillus Flavus và Aspergillus ký sinh và tồn tại rộng rãi trong thế giới tự nhiên. Các aflatoxin phổ biến là B1, B2, G1 và G2. Trong số các độc tố nấm mốc này, aflatoxin B1 có độc tính cao nhất, tiếp theo là G1, độc tính của B2 và G2 tương đối yếu. Do độc tính cao và khả năng gây ung thư cho người và động vật, nhiều quốc gia và cơ quan quản lý áp đặt
  giới hạn nghiêm ngặt về aflatoxin. Ủy ban châu Âu đã thiết lập mức tối đa cho aflatoxin B1 trong khoảng từ 2,0 đến 8,0 µg/kg và đối với tổng của cả bốn loại aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) trong khoảng từ 4,0 đến 15,0 µg/kg đối với các loại cây trồng như quả hạch, ngũ cốc và quả khô. Mức hành động được FDA Hoa Kỳ đặt lần lượt là 20 và 300 µg/kg đối với thực phẩm cho người và thức ăn chăn nuôi

 

1, Phạm vi áp dụng

• Tiêu chuẩn này được áp dụng để xác định hàm lượng đối với Aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi, thức ăn thủy sản; sản phẩm xử lý dùng trong chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản; Nguyên liệu dùng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, thức ăn thủy sản, sản phẩm xử lý dùng trong chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản.
• Phương pháp sử dụng thiết bị sắc ký lỏng (HPLC) với đầu dò huỳnh quang (FLD), LOQ của phương pháp là 2ppb.

2. Tài liệu tham khảo

• TCVN 6953:2001
• TCVN 7596:2007
• AOAC 990.33
• EC/657/2002
• Validation of Chromatographic Methods

3. Nguyên tắc:

• Aflatoxin trong mẫu được chiết với dung môi MeOH:H₂O, Sau đó làm sạch bằng SPE. Định lượng bằng HPLC với đầu dò FLD.

4. Hoá chất – thuốc thử:

Các hóa chất dùng trong phương pháp này đều là loại dùng cho HPLC, H₂O, không ion

• Acetonitrile
• Methanol
• Trifluoroacetic acid (TFA)
• MeOH – H₂O (50:50): Hút 100ml MeOH hòa tan với 100ml H₂­O, khuấy đều.
• ACN – H₂O (10:90): Hút 10ml ACN hòa tan với 900ml H₂­O, khuấy đều.
• Pha động:

• Pha động A: 0,1% Acid formid/ H₂O: hoà tan 100µl Acid formic trong 100ml H₂O
• Pha động B: Acetonitrile
• Pha động C: 0,1% Acid formid/ MeOH: hoà tan 100µl Acid formic trong 100ml MeOH
  • Khí Nitrogen (0,999 là tối thiểu)
  • Cột ái lực miễn dịch Aflahorn wide hoặc tương đương
  • Aflatoxin standard 5 mg/ml

5. Dụng cụ – Thiết bị

• Máy ly tâm lạnh 6000rpm
• Thiết bị làm khô bằng khí Nito
• Syring Filter, 0,22µm Bộ chiết pha rắn.
• Bể siêu âm
• Thiết bị đồng hóa mẫu: máy vortex, máy nghiền mẫu , máy cắt mẫu Multi-Prep Homogenizer
• Cột:  5µ C18 hoặ tương đương (HPLC)
• Cột: C18 C18 4,6 mm × 150 mm, 5 µm hoặc tương đương

6. Tiến hành

• • Chuẩn bị chuẩn

• Chuẩn làm việc 100 ppb: Dùng pipet hút chính xác 200ml vào bình 10ml, hòa tan và định mức bằng MeOH – H₂O (50:50). Chuẩn này lưu giữ được 1 tháng trong tủ lạnh ở 2 – 4⁰C, tránh sáng.
• Từ chuẩn làm việc pha ra các nồng độ sau: 2 ppb, 3 ppb, 5 ppb, 7 ppb, 10 ppb bằng dung môi MeOH – H₂O (50:50). Dung dịch chuẩn được đem đi chuẩn bị như mẫu thử.

Lưu ý: tất cả các chuẩn làm việc của aflatoxin đều phải được chuẩn bị trong bình nâu, tránh ánh sắng trực tiếp.

• • Chuẩn bị mẫu:

Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng trực tiếp.

Mẫu được xay nhuyễn và đồng hóa trước khi đem cân.

Cân 1 – 2g  mẫu đã được đồng hóa vào ống ly tâm 15 ml.

Thêm 5 ml dung dịch MeOH – H₂O (50:50) vào ống ly tâm, vortex trong 20 phút, sau đó đem ly tâm lạnh ở 6000 vòng/phút tại nhiệt độ 2⁰C.

Hút 4 – 6 ml dung dịch trên (tùy thuộc vào hàm lượng Aflatoxin có trong mẫu) vào ống tube 50 ml khác, thêm tiếp vào 20 – 30 ml H₂O. Sau đó đem vortex hổn hợp trên khoảng 1 phút.

• • Chiết SPE:

Phương pháp này sử dụng cột ái lực miễn dịch để loại bỏ ảnh hưởng nền mẫu: có thể sử dụng cột Aflahorn wide hoặc tương đương

• Dung môi họat hóa có sẵn trong cột Aflarhorn: hoạt hóa bằng 50% dung môi có sẵn trong cột.
• Thêm dung dịch chiết mẫu vào (tốc độ khỏang 3 – 5 giọt/10giây)
• Rửa tạp chất bằng 1 ml H₂
• Hút khô cột chiết.
• Rửa giải bằng 8ml ACN vào ống ly tâm 15 ml.
• Hút khô cột chiết
• Đem dung dịch rửa giải đi thổi khô bằng khí Nitơ.
• Hổn hợp sau khi làm khô được tạo dẫn xuất bằng cách cho thêm vào 100µl TFA (đậm đặc), vortex khoảng 30s, hổn hợp trên được ủ trong tối trong 15 phút.
• Sau đó thêm vào 900µl dung dịch ACN:H₂O (10:90), vortex.
• Dùng Syringe filter 0,22µm để lọc dung dịch trên, tiêm vào HPLC – FLD.

Lưu ý: Không để cột khô trong quá trình hoạt hóa và thêm mẫu vào.

• Mẫu QC (mẫu kiểm soát):

• Mẫu âm tính: spike ở nồng độ bằng LOQ của phương pháp hoặc điểm giữa đường chuẩn.
• Mẫu dương tính: spike bằng 0,5; 1; hoặc 2 lần nồng độ mẫu
• Mẫu đối chiếu được chuẩn bị và chiết như mẫu.
• Mẫu Blank: mẫu âm tính hoặc dung môi
  • Điều kiện HPLC – FLD, LC/MS/MS
    • Điều kiện HPLC – FLD
      • Pha động A: 0,1% Acid formid/ H₂O (60%)
      • Pha động B: ACN (10%)
      • Pha động C: 0,1% Acid formid/ MeOH (30%)
      • Tốc độ dòng: 0,5 ml/min
      • Thể tích tiêm: 20µl
      • Cột:  5µ C18 hoặc tương đương
      • Bước sóng kích thích: 362nm
      • Bước sóng phát xạ: 455nm

Thời gian	A	B	C
35 phút	68%	22%	10%

7. Biểu thị kết quả

Tham khảo:

HPLC Phân tích trên máy HPLC Agilent

Chuyển giao giải pháp phân tích

Tel: 0972 220 906

Email: admin@newtech-corp.com